Développer des méthodes d’amplification moléculaire pour le diagnostic rapide des infections des voies respiratoires causées par des agents pathogènes bactériens

Les méthodes actuelles de diagnostic des infections bactériennes des voies respiratoires sont lentes et souvent marginales pour la gestion des patients si l’adéquation de l’échantillon n’est pas confirmée avant la culture. Les tests d’amplification moléculaire, très sensibles, peuvent fournir des résultats en heures plutôt qu’en jours mais ne distinguent pas La détermination de la méthode de référence à utiliser pour évaluer un nouveau test moléculaire, avec l’aide de la Food and Drug Administration des États-Unis, est essentielle avant d’entreprendre le développement d’un produit potentiel. Bien que l’expectoration puisse être la La qualité médiocre de ces spécimens peut poser des problèmes pour les essais cliniques de nouveaux tests d’amplification. Il existe encore de nombreuses lacunes dans notre compréhension de l’interaction entre la colonisation et l’infection et du rôle que peuvent jouer les tests d’amplification. jouer dans le guidage de la thérapie anti-infectieuse Ainsi, les paramètres de performance d’une nouvelle méthode de diagnostic doivent correspondre étroitement à une déclaration d’utilisation prévue définie avec précision

Le laboratoire de microbiologie clinique a longtemps mis au point des méthodes précises pour diagnostiquer les infections bactériennes des voies respiratoires Les méthodes de culture semi-quantitative utilisées dans la plupart des laboratoires de microbiologie clinique aujourd’hui permettent de récupérer et d’identifier une grande variété d’espèces bactériennes. ne peut pas différencier entre la colonisation et l’infection, en particulier lorsque la majorité des échantillons soumis à des tests sont contaminés par la flore des voies respiratoires supérieures ou sont simplement de la salive, comme le montre la coloration de Gram En fait, une coloration de Gram expectorée peut être utilisée pour vérifier la qualité d’un échantillon et guider la thérapie empirique , mais la fermeture des laboratoires satellites où les résidents, les boursiers et les médecins traitants pouvaient interpréter leurs propres taches de Gram pour faciliter la prise de décision rapide pour la gestion des patients a considérablement allongé il faut du temps pour que les médecins lts Reconnaître l’infection chez un patient ventilé est encore plus difficile, car la colonisation de l’arbre respiratoire par une succession de bactéries gram-négatives est fréquente pendant les séjours prolongés à l’hôpital, et la plupart des espèces récupérées par aspiration endotrachéale Considérés comme de vrais pathogènes s’ils sont récupérés dans le sang Ainsi, de nombreux médecins se sentent obligés d’initier une thérapie antimicrobienne empirique sur la base des résultats de culture des aspirats endotrachéaux La raison principale de la culture bactérienne est d’optimiser les traitements anti-infectieux. En cet âge de la résistance aux antimicrobiens, les délais actuels allant de quelques heures à des tests complets sont souvent insuffisants pour des soins optimaux aux patients [ ,] Avec la gamme sans cesse croissante d’agents pathogènes multirésistants, y compris Klebsie Lla pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, et Acinetobacter espèces, obtenir un traitement anti-infectieux pour la pneumonie bactérienne corriger la première fois est essentielle pour les résultats positifs des patients [,,] Ainsi, à de nombreux médecins, l’identification rapide et précise des pathogènes respiratoires bactériennes, en particulier pour pneumonie nosocomiale et la pneumonie associée au respirateur VAP, est devenu un besoin clinique non satisfait. Dans les directives de gestion de la maladie publiées par l’European Respiratory Society, on a noté le rôle potentiel des méthodes d’amplification moléculaire dans l’amélioration du diagnostic des infections des voies respiratoires inférieures. les médecins jugent que le potentiel d’amélioration de la sensibilité et des délais d’exécution plus rapides sont attrayants; l’industrie devra relever des défis et surmonter les obstacles pour élaborer et commercialiser des tests d’amplification moléculaire des agents pathogènes respiratoires bactériens.

METHODES DE DIAGNOSTIC DE COURANT POUR DES INFECTIONS DU TRACTUS RESPIRATOIRE

La méthode de culture à base de gélose semiquantitative actuelle utilisée pour analyser les expectorations expectorées chez les patients suspects de pneumonie extra-hospitalière CAP ou HAP est lente et les résultats peuvent être trompeurs, en particulier si une coloration de Gram n’est pas effectuée en parallèle pour vérifier l’adéquation des échantillons Échantillons expectorés d’expectoration qui contiennent & gt; cellules épithéliales squameuses et & lt; Malheureusement, seuls% à% des échantillons d’expectoration obtenus de patients hospitalisés récemment admis avec une PAC sévère satisfaisaient aux critères d’acceptation ci-dessus, selon une récente méta-analyse d’études publiées sur la PAC Même si l’échantillon d’expectoration est jugé adéquat en utilisant les critères de coloration de Gram, la culture peut ne pas donner un pathogène évident La valeur prédictive la plus élevée pour une culture d’expectoration survient lorsque la coloration de Gram montre un morphotype prédominant, par exemple, des cocci gram-positifs en forme de lancette par paires et la culture donne la croissance prédominante d’un seul pathogène respiratoire reconnu de ce morphotype, par exemple Streptococcus pneumoniae Malheureusement, cette concordance diminue rapidement lorsque les spécimens sont collectés. après le début du traitement antimicrobien ou lorsque leur arrivée au laboratoire de microbiologie est significative En revanche, pour la pneumonie par aspiration, qui est souvent causée par un mélange d’espèces bactériennes anaérobies, une coloration de Gram des expectorations est souvent le seul test diagnostique de valeur, car les cultures de crachats ne sont pas anaérobies et les cultures aérobies ne donnent que Flore respiratoire mixte mixte L’autre problème qui affecte les soins aux patients est la lenteur de la procédure d’essai. Lorsque la sensibilité aux antimicrobiens est incluse, la méthode de culture nécessite un minimum d’heures de travail. Il est souvent trop tard pour guider efficacement l’antibiothérapie. traitement infectieux, en particulier lorsque le pathogène bactérien est multirésistante Les tests d’antigènes urinaires pour les pneumocoques et Legionella pneumophila peuvent fournir des résultats rapides, mais les tests commerciaux disponibles ont une plage de sensibilité variable% -% et les tests antigéniques pour L pneumophila sont limités au sérogroupe. ]

DÉFIS POUR LES FABRICANTS DE TEST DE DIAGNOSTIC

L’utilisation de méthodes d’amplification de l’acide nucléique en temps réel pour améliorer le diagnostic des infections des voies respiratoires et raccourcir le temps nécessaire pour placer les patients sous traitement approprié. PCR en temps réel , pyroséquençage et acide nucléique les tableaux sont autant d’options pour améliorer la rapidité et la précision des résultats de laboratoire Le principal défi pour l’industrie est de développer des tests non seulement rapides, mais aussi facilement accessibles et perçus par les laboratoires ou les systèmes de santé comme rentables. Rapide mais indisponible le soir ou la nuit ou le week-end en raison de sa complexité technique limite la valeur médicale du test Du point de vue de l’industrie, la rentabilité doit être déterminée non seulement par comparaison avec les coûts des méthodes conventionnelles plus lentes. mais aussi en tenant compte des économies réalisées grâce à l’optimisation de la thérapie antimicrobienne, de la diminution de Pour avoir un impact positif sur la prise en charge des patients, les tests d’amplification moléculaire devront fournir des résultats clairs et définitifs qui fourniront aux médecins les données nécessaires pour démarrer ou, dans certains cas, refuser des agents antimicrobiens l’industrie doit déterminer quelle combinaison de cibles moléculaires et d’échantillons cliniques produira des résultats qui guideront efficacement les schémas thérapeutiques anti-infectieux chez les patients atteints de pneumonie ou d’autres maladies des voies respiratoires; quelle méthode de référence fournira les résultats les plus significatifs pour le développement de tests et les essais cliniques; et quels essais les entreprises pourront se permettre de développer, compte tenu des coûts de développement et des essais cliniques et des calendriers de remboursement en constante évolution des assureurs privés et du gouvernement fédéral. Le retour sur investissement potentiel est un facteur clé lorsque l’industrie choisit les tests L’élaboration de nouveaux tests de diagnostic, en particulier lorsque les méthodes de référence ne sont pas évidentes, est certainement l’un des principaux défis auxquels l’industrie doit faire face.

CHOIX DE CIBLES MOLÉCULAIRES

Les dosages moléculaires peuvent cibler soit un seul agent pathogène, tel que Mycobacterium tuberculosis , soit plusieurs agents pathogènes respiratoires en un seul essai Plusieurs essais multiplex pour pathogènes respiratoires viraux ont été décrits [,,], dont certains ont été commercialisés et ont reçu la FDA Il y a des avantages à la fois pour les approches mono- pathogènes et multiplex

DÉTECTION D’UNE ESPÈCE BACTÉRIENNE UNIQUE

Certains pathogènes respiratoires bactériens provoquent des syndromes cliniques si distincts que les tests qui les ciblent individuellement ont encore une utilité clinique. Ils comprennent des organismes tels que M tuberculosis, L pneumophila et Bordetella pertussis. Des tests moléculaires ont été développés pour tous ces organismes, bien que par souci de brièveté. , la discussion sera limitée aux questions entourant le développement de tests pour M tuberculosis, où il y a peu de doute que la détection des organismes est fortement associée à la maladie

DÉTECTION RAPIDE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

L’Organisation mondiale de la santé a rapporté que le nombre de nouveaux cas de tuberculose dans le monde était estimé à environ un million Bien que le nombre total de cas de tuberculose diminue aux États-Unis, la proportion de cas parmi les étrangers augmente régulièrement Du point de vue diagnostique, le fait que dans plus d’un cas de tuberculose diagnostiqué chez des réfugiés et des immigrants à destination des États-Unis, les taches acido-résistantes des expectorations expectorées des patients ont donné des résultats négatifs, risque d’être oublié. programmes de dépistage de la tuberculose qui reposent principalement sur la coloration acide des sécrétions respiratoires au lieu des radiographies thoraciques et des méthodes de culture plus lentes En outre, les infections chez les personnes nées à l’étranger sont plus susceptibles d’être causées par des souches multirésistantes. des cas parmi les personnes domestiques des États-Unis Ainsi, particulièrement du point de vue des programmes de dépistage des immigrants et des réfugiés, il existe Les tests moléculaires ont été utilisés pour la détection directe de M tuberculosis dans des échantillons cliniques pendant plus d’une décennie, mais ces tests montrent généralement des niveaux de sensibilité inacceptablement bas pour les frottis. échantillons négatifs Cependant, un test commercial basé sur la PCR récemment publié qui est actuellement disponible uniquement à l’extérieur des États-Unis a montré une sensibilité de>% sur des échantillons positifs à culture à frottis négatif dans une étude multicentrique multicentrique la détection des marqueurs de résistance en plus de la détection directe des cibles d’ADN de tuberculose M sont importantes pour guider la thérapie antituberculeuse, en particulier à l’ère des souches multirésistantes et extrêmement résistantes [,,] L’inconvénient actuel de développer et de commercialiser des tests pour M tuberculosis aux États-Unis est que les tests pour cet organisme sont classés par la FDA en tant que classe Cela signifie que les tests moléculaires pour détecter l’organisme nécessitent une application PMA pré-commercialisation plutôt que la moins rigoureuse, mais toujours techniquement exigeante et coûteuse. PMA soumission, l’entreprise doit démontrer de manière indépendante que son dispositif est sûr et efficace dans le contexte de son utilisation prévue. Cela comprend la démonstration par des essais cliniques soigneusement conduits que les résultats des tests sont très précis par rapport à une méthode de référence robuste et que l’entreprise a conçu et mis en œuvre des contrôles suffisants de son processus de fabrication, y compris la conception du produit, la production et le contrôle de qualité pour garantir que la méthode ou le dispositif puisse être fabriqué de manière reproductible. l’appareil En revanche, la soumission ak nécessite seulement que l’entreprise démontre à travers cli Essais cliniques que son dispositif ou méthode est «essentiellement équivalent» à un «dispositif ou méthode de prédicat», c’est-à-dire un dispositif préalablement approuvé par la FDA pour être utilisé aux États-Unis. une PMA, la reclassification des tests M tuberculosis en Classe III selon la réglementation actuelle constitue un obstacle important au développement et à la commercialisation des tests aux Etats-Unis principalement en raison de la complexité, de l’ampleur et du coût des essais cliniques requis. Cependant, bien qu’il existe des données publiées décrivant les performances du test GenProbe Amplified M tuberculosis direct MTD, le test Roche Amplicor MTB, les Cobas Le test Amplicor, le test Abbott LCx et le test BDA ProbeTec Strand Displacement Amplification SDA pour détecter Comme l’ont noté Ling et al dans leur récent méta-examen des méthodes d’amplification de l’acide nucléique, le GenProbe MTD est maintenant le seul test autorisé par la FDA disponible aux États-Unis. les options pour la détection de la tuberculose M aux États-Unis peuvent refléter à la fois des obstacles réglementaires réels et perçus et des obstacles liés au marché qui sont assez importants pour garder de nombreux acteurs de l’industrie du diagnostic à l’écart

DETECTION DIRECTE D’ORGANISMES MULTIPLES DANS DES ECHANTILLONS DE VOIES RESPIRATOIRES PAR SYNDROME

Les dosages multiplex potentiels pour les maladies des voies respiratoires causées par des agents pathogènes bactériens comprennent ceux pour CAP, HAP, PVA, bronchite aiguë, sinusite, exacerbation de la bronchopneumopathie chronique obstructive et la pneumonie par aspiration. Un nombre limité de pathogènes bactériens répondra aux besoins des médecins et fournira des données adéquates pour initier ou modifier un traitement anti-infectieux Les cibles choisies pour les tests moléculaires sont généralement les pathogènes clés susceptibles d’être présents dans les échantillons respiratoires. la sélection des cibles pour inclure les gènes clés de résistance aux antimicrobiens qui modifieraient la thérapie existante ou guider la thérapie empirique devrait également être envisagée. Les groupes potentiels de cibles pour les échantillons respiratoires obtenus de patients atteints de CAP, HAP ou VAP sont présentés dans le tableau. en particulier ceux qui induisent la résistance au carbapénème La résistance au doripénème, à l’ertapénème, à l’imipénème et au méropénème peut être très utile, en particulier parce que les carbapénèmes jouent maintenant un rôle important dans la thérapie empirique de la PAH et de la VAP Par exemple, les β-lactamases de Klebsiella pneumoniae carbapénémases codées par blaKPC. les gènes, qui induisent la résistance aux pénicillines; les céphalosporines, y compris les céphalosporines à spectre étendu; et carbapenems peuvent compromettre le traitement des infections causées par K pneumoniae, Enterobacter aerogenes et autres espèces d’Enterobacteriaceae , alors que les métallo-β-lactamases, IMP et VIM codées respectivement par les gènes blaIMP et blaVIM Toutes les β-lactamines, y compris les carbapénèmes à l’exception des monobactames, peuvent compromettre le traitement des infections à Pseudomonas aeruginosa Les β-lactamases spécifiques à l’OXA, comme l’OXA, qui induit également la résistance aux céphalosporines et aux carbapénèmes à spectre étendu, peuvent également Infections à Acinetobacter Pour les pathogènes à Gram positif, la présence de mecA dans les échantillons positifs pour S aureus suggère que la vancomycine ou peut-être le linézolide, seul ou en combinaison avec d’autres agents anti-infectieux, est nécessaire. dosages, puis les résultats négatifs pour un pathogène spécifique devraient inciter les médecins à suspendre le traitement de cet agent infectieux. g, suspendre un traitement contre le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA) si le test moléculaire est négatif Bien sûr, les laboratoires peuvent toujours cultiver des échantillons respiratoires positifs par des méthodes moléculaires pour récupérer le pathogène afin d’effectuer des tests de sensibilité aux antimicrobiens standard. obtenu en culture pure Le test de sensibilité standard fournit un profil de sensibilité plus large qui s’étend au-delà des quelques gènes de résistance aux antimicrobiens susceptibles d’être inclus dans un test moléculaire

Tableau Cibles potentielles pour les essais d’amplification moléculaire multiplexe ou individuelle par syndrome [,,,,] CAP / exacerbations de la MPOC HAP / VAP Organismes individuels Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Mycobacterium tuberculosis Haemophilus influenzae mecA Génie Bordetella pertussis gène blaTEM Pseudomonas aeruginosa … Moraxella catarrhalis blaVIM, blaIMP génotypage … Staphylococcus aureus Acinetobacter spp … mecA généa blaOXA genesd … Mycoplasma pneumoniae Enterobacteriaceae … Chlamydophila pneumoniae blaKPC genec … Chlamydophila psittaci Stenotrophomonas maltophilia … Legionella pneumophila … … CAP / exacerbations de BPCO HAP / VAP Organismes individuels Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Mycobacterium tuberculosis Haemophilus influenzae mecA genea Bordetella pertussis génome de BlaTEM Pseudomonas aeruginosa … Moraxella catarrhalis blaVIM, génotype bla … Staphylococcus aureus Acinetobacter spp … mecA gen ea blaOXA genesd … Mycoplasma pneumoniae Enterobacteriaceae … Chlamydophila pneumoniae blaKPC genec … Chlamydophila psittaci Stenotrophomonas maltophilia … Legionella pneumophila … … NOTE CAP, pneumonie acquise en communauté; MPOC, maladie pulmonaire obstructive chronique; PAH, pneumonie nosocomiale; PAV, pneumonie associée à un ventilateur. Résistance à tous les agents β-lactamines à l’exception des nouveaux Séphalosporines S aureus résistant à la méthicilline. Résistance aux pénicillines et aux céphalosporines de première génération. Résistance aux céphalosporines et aux carbapénèmes. Les métallo-β-lactamases, telles que les VIM et les IMP, n’interviennent généralement pas dans la résistance aux monobactamsd. Certaines β-lactamases OXA peuvent induire une résistance aux carbapénèmes.

ÉCHANTILLONS RESPIRATOIRES POUR L’ANALYSE

Des échantillons respiratoires expectorés sont de loin les échantillons respiratoires les plus couramment soumis au laboratoire de microbiologie clinique, mais sont aussi les Comme l’indique la note d’orientation de la CAP de l’American Infectious Diseases Society of America / American Thoracic Society, l’un des problèmes liés aux tests de diagnostic des infections respiratoires est dû à la mauvaise qualité de la plupart des échantillons microbiologiques d’expectoration et au faible rendement des cultures positives. « Obtenir des échantillons du site d’infection qui ne sont pas contaminés par la flore des voies respiratoires supérieures est un problème constant [,,] Aspirations endotrachéales de patients ventilés sont souvent de meilleure qualité que celle des expectorations expectorées de patients atteints de HAP mais peuvent être contaminé par la flore des voies respiratoires supérieures Les échantillons de broussailles protégés sont plus susceptibles de produire des échantillons du site d’infection, mais nécessitent beaucoup plus d’efforts pour obtenir un marché beaucoup plus petit pour un nouveau test moléculaire. En fait, il existe un écart important dans nos connaissances des tests pour les agents pathogènes bactériens seraient effectués sur des échantillons d’expectoration expectorés, comparés aux performances sur les BAL ou les échantillons de brosse protégés du même patient collectés dans une période similaire. Cette lacune de connaissances est également un obstacle au développement des tests. les expectorations, compte tenu de tous les problèmes de qualité des échantillons, peuvent ne pas intéresser suffisamment les médecins pour en faire un produit financièrement viable du point de vue de l’industrie

CHOIX D’UNE MÉTHODE DE RÉFÉRENCE POUR LE DÉVELOPPEMENT D’ESSAIS ET LES ESSAIS CLINIQUES

Les programmes d’intendance des micro-organismes insistent souvent sur la nécessité de traiter les infections, mais de retenir les agents antimicrobiens chez les patients asymptomatiques . La sensibilité accrue des méthodes moléculaires est essentiellement rejetée si les médecins perçoivent le test comme «trop sensible». L’équilibre entre la sensibilité et la spécificité et par analogie les valeurs prédictives positives et négatives pour les tests moléculaires est un autre exemple d’une lacune critique dans notre compréhension de la meilleure manière d’appliquer les diagnostics moléculaires Quantification des cibles La réponse aux tests moléculaires Un rapport Cochrane récent conclut que l’utilisation de cultures quantitatives n’a pas amélioré les résultats des patients atteints de PVA, par rapport aux résultats des patients qui ont été gérés avec des résultats qualitatifs Cependant, la diminution du temps de réponse des résultats des tests moléculaires peut s’avérer avantageuse méthodes de culture c.-à-d., qualitative et quanti Pour illustrer ce point, une brève revue de la méthode de culture semi-quantitative pour les expectorations expectorées est appropriée. Les évaluations de la croissance bactérienne sont effectuées sur une série de plaques de gélose sans étape d’enrichissement. La constellation de croissance les milieux comprennent généralement de la gélose au sang, de la gélose au chocolat pour les organismes exigeants, de la gélose MacConkey ou un milieu sélectif similaire pour les organismes Gram négatif et de la colistine-acide nalidixique ou un milieu sélectif similaire pour les pathogènes Gram positif. plus « la croissance des pneumocoques mélangés avec d’autres flores respiratoires d’un échantillon expectoré d’expectoration sur la gélose au sang ou au chocolat serait probablement rapportée comme » flore respiratoire mixte « souvent sans mention spécifique des pneumocoques sur le rapport, alors que la croissance forte des pneumocoques sur la même gélose plaque peut être signalé comme « quatre plus de croissance, S pneumoniae » Bien que les deux échantillons conta dans S pneumoniae, dans le premier exemple, l’organisme est considéré comme une flore normale et n’est pas signalé, alors que dans le dernier il acquiert le statut de « pathogène » et il est probable que les deux échantillons donneraient un résultat d’amplification moléculaire positif. quantification de la quantité de cible présente avec une valeur seuil définie qui corrèle avec l’infection plutôt que la colonisation peut être nécessaire pour donner confiance dans les résultats moléculaires Ceci ajoute de la complexité au processus de développement de test parce que le résultat du test n’est pas simplement absence de l’organisme cible, mais techniquement réalisable Des concentrations élevées de séquences d’organismes cibles reconnues par le processus d’amplification suggèrent fortement l’infection, mais peut-on croire que l’absence d’amplification est une indication de l’absence d’infection s’il n’y a pas eu d’évaluation initiale? spécimen pour s’assurer qu’il était de qualité adéquate Sera-t-il nécessaire d’inclure un marqueur de cellule hôte? pour indiquer que l’échantillon provient du site de l’infection et n’est pas de la salive Bien que les taches de Gram soient critiques pour l’interprétation des résultats de culture, l’obtention d’une coloration de Gram avant d’effectuer un test moléculaire irait à l’encontre du test moléculaire rapide , en particulier celui qui pourrait éventuellement être utilisé en dehors du laboratoire de microbiologie clinique comme un test «au point de service» Une fois de plus, nous avons identifié une lacune dans nos connaissances qui est essentielle pour le développement du test. nouveaux tests moléculaires, que les points finaux qui représentent des résultats positifs pour chaque espèce bactérienne soient établis, en particulier pour les organismes qui peuvent à la fois coloniser et infecter les voies respiratoires Quantification ne serait pas nécessaire pour des organismes tels que M tuberculosis ou B pertussis cet organisme est synonyme de maladie La question de savoir si les cultures bactériennes quantitatives seraient nécessaires Pour les essais cliniques, il faut répondre aux seuils appropriés pour la culture quantitative, mais plusieurs sources suggèrent que les nombres suivants d’organismes d’une seule espèce bactérienne indiquent une infection et non une colonisation: pour les expectorations expectorées, & gt; x unités formant des colonies CFU / mL; pour les aspirations endotrachéales, & gt; x UFC / mL; pour le lavage bronchoalvéolaire, & gt; x UFC / mL; et pour un spécimen de brosse protégé, & gt; x CFU / mL [,,] Il sera probablement nécessaire d’évaluer l’analyse semi-quantitative des expectorations et des méthodes quantitatives telles que les échantillons BAL en parallèle pour indiquer si un test d’amplification moléculaire pourrait être utilisé avec succès sur des expectorations d’expectorations. plus sensible que la culture, on peut se demander si des bouillons d’enrichissement devraient être requis pour maximiser la détection par culture pendant les essais cliniques. Cependant, il n’y a pas de bouillon d’enrichissement défini pour la majorité des pathogènes respiratoires bactériens; ainsi, il est peu probable que cela ait de la valeur

DÉVELOPPEMENT DU DOSAGE – QUELLE EST LA NORME OR POUR L’IDENTIFICATION BACTÉRIENNE

Une question qui se pose lors de l’utilisation des méthodes d’amplification est de savoir si les produits d’amplification représentent vraiment les séquences de l’organisme cible. Pour établir cela, il est souvent nécessaire de déterminer la séquence d’acide nucléique d’un échantillon des produits d’amplification ciblés. pathogène Le séquençage de l’ADN est souvent supposé être complètement précis, montrant le% de sensibilité et de spécificité en particulier par les biologistes non-moléculaires Cependant, en raison de divers facteurs techniques, y compris la qualité du modèle de séquençage, la quantité d’ADN contaminant provenant d’autres sources, la sélection et la qualité des amorces utilisées pour l’amplification et le séquençage, la robustesse du logiciel d’appel de base et la méthode pour compiler la « séquence consensus » à partir de multiples réactions directes et inverses, le séquençage ne représente pas toujours le standard de référence ultime ] Néanmoins, les entreprises doivent maintenant considérer quelles mesures de Par exemple, l’utilisation des scores de qualité obtenus au moyen des programmes informatiques « Phred » et « Phrap » constituerait des normes acceptables si le séquençage était inclus dans la conception d’essais cliniques. Par exemple, pour des séquences de séquençage individuelles, a & lt; les bases de scores de qualité «Phred» cumulatives où le logiciel Phred estime la probabilité statistique d’une détermination de base inexacte sont souvent considérées comme inacceptables, car elles représentent une probabilité de niveau d’erreur de% D’autre part, en utilisant un autre logiciel, un Le score de qualité « Phrap » de, qui est le score de qualité de la séquence consensus assemblée à partir de lectures multiples d’une séquence d’ADN équivalente à un taux d’erreur de base pour chaque base séquentielle, est souvent considéré comme acceptable. : // wwwphrapcom / backgroundhtm Ces paramètres clés de qualité n’ont pas encore été promulgués par les organismes de réglementation, bien que les données de séquençage aient été incluses dans plusieurs soumissions. Ces lignes directrices seraient utiles aux développeurs de tests diagnostiques puisqu’ils envisagent de commencer des essais cliniques de nouveaux produits diagnostiques.

SENSIBILITÉ ET SPÉCIFICITÉ, VALEURS PRÉDICTIVES POSITIVES ET NÉGATIVES

Les paramètres clés qui définissent la précision d’un nouveau test, comparés à la précision de la méthode de référence, comprennent la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives. Actuellement, il n’y a pas de consensus sur lequel de ces paramètres est le plus critique. tests moléculaires pour pathogènes respiratoires Est un test très sensible qui manque rarement la présence d’un agent pathogène donné dans un échantillon respiratoire souhaitable, ou est un test avec une valeur prédictive négative élevée indiquant l’absence d’un agent pathogène donné de plus grande valeur Le premier scénario indique que Un agent antimicrobien est probablement nécessaire, tandis que le dernier indique que les agents antimicrobiens peuvent être retenus. Bien que les taux de sensibilité élevée et de spécificité élevée soient souhaitables et parfois réalisables dans un essai, les valeurs prédictives dépendent de la prévalence de la maladie et ne peuvent être manipulées. , il est essentiel de définir l’utilisation prévue de l’essai avant l’initiation de tout c Essais cliniques Il est préférable de le faire en consultation avec les représentants du centre de la FDA approprié. Les autres questions qui se posent concernant la conception des essais cliniques comprennent les tranches d’âge, l’origine ethnique et la sévérité clinique des populations étudiées. prévalence et populations à faible prévalence, stratifiées non seulement par âge mais aussi par sexe et même groupe socioéconomique Plus la population étudiée est large et diversifiée, plus le coût de la conduite de l’essai est important. Les directives d’un PMA peuvent devenir très rapidement trop chères L’utilisation prévue du test est peut-être l’une des décisions les plus critiques que l’industrie doit prendre avant de lancer un développement.

UN ESSAI VAP POSSIBLE

Pour illustrer les problèmes ci-dessus, un essai d’amplification moléculaire possible pour VAP est décrit. L’utilisation prévue pour le test est une aide au diagnostic où les résultats du test sont considérés en association avec d’autres informations de laboratoire et cliniques pour établir un diagnostic de VAP. l’utilisation prévue inclut la capacité du test à guider la thérapie anti-infectieuse doit être considérée soigneusement, par exemple, cet aspect du test peut-il être prouvé dans un essai clinique Les organismes cibles sont S aureus, P aeruginosa, Acinetobacter baumannii, une séquence d’ADN commune Toutes les entérobactéries et séquences cibles hautement spécifiques des déterminants de la résistance aux antimicrobiens suivants: mecA, blaKPC, blaIMP, blaVIM et blaOXA Les échantillons cibles sont des échantillons de brosses bronchiques protégées et des aspirats endotrachéaux. Les méthodes de référence comprennent des cultures quantitatives sur du chocolat noir, MacConkey et l’agar CNA; une coloration de Gram du spécimen; et un diagnostic clinique de fièvre VAP, leucocytose et sécrétions respiratoires purulentes soutenues par des résultats radiologiques Si un haut degré de corrélation entre les résultats de culture, les résultats de coloration de Gram, les résultats des tests moléculaires et le diagnostic clinique sont atteints dans les essais alpha, Si les résultats du test sont prometteurs, un test moléculaire qui pourrait finalement être effectué sur des échantillons d’expectoration provenant de patients atteints de PAH plutôt que de PVA pourrait être réalisable. différentes sélections de cibles

RÉSUMÉ

La mise au point de tests moléculaires pour les agents pathogènes respiratoires bactériens, en particulier les organismes qui peuvent être des colonisateurs asymptomatiques et des pathogènes manifestes des voies respiratoires, pose de nombreux défis. Définir la méthode de référence et l’utilisation du produit avant de commencer les études cliniques Bien que l’expectoration puisse être un échantillon de choix du clinicien en raison de la facilité de collecte, la qualité médiocre de ces échantillons peut nécessiter le développement d’une cible cellulaire hôte unique pour garantir l’adéquation des échantillons. Les essais d’amplification moléculaire seront coûteux et les essais cliniques être cher, mais le besoin est grand Il existe encore de nombreuses lacunes dans notre compréhension de l’interaction entre la colonisation et l’infection. La question clé que l’industrie doit répondre est: «Le jus vaut-il la peine?» Merci Dr. Peter Dailey, Ellen Jo Baron, David Persing, Kerry Flom, Michele Schoonmaker, Alan Wortman et Russel Enns pour leur contribution au développement de cet article. Soutien financier Ce travail a été soutenu par le parrainage de CepheidSupplement Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé « Atelier sur les diagnostics moléculaires pour les infections respiratoires ». AstraZeneca Pharmaceuticals, Bio Merieux, Inc, Cepheid, Gilead Sciences, Intelligent MDX, Inc, Inverness Medical Innovations, et Roche Molecular Systems ont fourni un soutien financier uniquement dans le but de publier le supplément. Conflits d’intérêts potentielsF CT est un employé de Cepheid, un laboratoire moléculaire. entreprise de diagnostic