Diagnostic clinique précoce et en laboratoire de la zygomycose pulmonaire invasive, extrapulmonaire et disséminée

Étant donné l’importance d’un diagnostic précis et rapide de la mucormycose invasive pour guider l’initiation rapide de l’amphotéricine B et d’une éventuelle intervention chirurgicale, une approche multidisciplinaire coordonnée de l’évaluation clinique est essentielle pour une intervention thérapeutique opportune, une survie améliorée et une morbidité réduite. L’évaluation en laboratoire de la mucormycose comprend les méthodes conventionnelles d’examen direct et de culture des tissus, des sécrétions respiratoires, du liquide de lavage broncho-alvéolaire et d’autres fluides. Toutefois, comme les outils diagnostiques conventionnels ont une sensibilité limitée, l’amplification moléculaire avancée les systèmes, les tests de détection des antigènes, les profils protéomiques et la détection des métabolites peuvent compléter les approches existantes pour améliorer le taux de diagnostic précoce de la mucormycose invasive

PRINCIPES DE DIAGNOSTIC DE LA MUCORMYCOSE

La mucormycose invasive entraîne une morbidité et une mortalité sévères chez les greffés de cellules souches hématopoïétiques et les greffés d’organes solides et chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques, de diabète sucré, de brûlures, de traumatismes et d’insuffisance pondérale à la naissance. Le diagnostic précoce de la mucormycose est important, et une intervention thérapeutique rapide peut prévenir l’invasion tissulaire progressive et ses séquelles. Tableau Ces séquelles comprennent l’angioinvasion et les lésions tissulaires directes des voies respiratoires, l’extension directe des poumons vers les gros vaisseaux, l’invasion. Le diagnostic précoce peut également réduire le besoin ou l’étendue de la résection chirurgicale, la défiguration et la souffrance. Enfin, un diagnostic précoce peut améliorer les résultats et la survie. diagn Chamilos et ses collègues ont démontré l’impact d’un traitement retardé par l’amphotéricine B sur les résultats chez les patients consécutifs atteints de malignité hématologique et de mucormycose Le traitement tardif a entraîné une augmentation de la mortalité de plusieurs semaines, par rapport au traitement précoce% vs% De plus, le traitement tardif de la mucormycose invasive était un prédicteur indépendant des résultats médiocres dans le rapport de cotes de l’analyse multivariée, [% intervalle de confiance, -]; P =

Prévention des lésions tissulaires directes des poumons, du cerveau et des sinus Prévention de l’extension dans les sites critiques: yeux, cerveau, gros vaisseaux Prévention de la progression vers la dissémination Réduction du besoin ou de l’étendue de la résection chirurgicale Réduction de l’exérèse chirurgicale Nécessité d’une chirurgie défigurante Infiltration réduite des fibres nerveuses sensorielles Amélioration des résultats et de la survie Bénéfice Prévention de l’angioinvasion Prévention des lésions tissulaires directes des poumons, du cerveau et des sinus Prévention de l’extension dans les sites critiques: yeux, cerveau, grands vaisseaux nécessité ou étendue de la résection chirurgicale Réduction du besoin de chirurgie défigurante Réduction de la souffrance invasion des fibres nerveuses sensorielles Amélioration des résultats et de la survie View Large

AMÉLIORATION DU DIAGNOSTIC PRÉCOCE DE LA MUCORMYCOSE INVASIVE

Si l’initiation précoce d’une thérapie antifongique est bénéfique dans l’issue de la mucormycose invasive, le développement de méthodes diagnostiques améliorées devrait devenir un objectif important pour l’étude. Ceci peut être réalisé par la reconnaissance des facteurs hôtes, une évaluation soigneuse des manifestations cliniques, l’utilisation précoce de la tomodensitométrie Modalités de TDM et d’imagerie par résonance magnétique, expertise des préparations histologiques et cytologiques, utilisation optimale des méthodes microbiologiques cliniques et mise en œuvre des progrès de la détection moléculaire. La reconnaissance des facteurs hôtes contribue significativement à l’évaluation du risque de mucormycose invasive chez les patients. Cependant, des informations supplémentaires obtenues au cours de la dernière décennie soulignent l’augmentation de la population à risque de mucormycose invasive, comme les patients atteints de diabète de type, de transplantation de cellules souches d’organes solides et de cellules souches hématopoïétiques. receveurs, patients atteints de maladies auto-immunes, nouveau-nés, utilisateurs de drogues intraveineuses illicites et patients souffrant de brûlures, de traumatismes ou de plaies chirurgicales. Les patients présentant une réaction du greffon contre l’hôte présentent un risque élevé de mucormycose en raison de l’immunosuppression L’exposition concomitante à la prophylaxie par le voriconazole chez les patients immunodéprimés atteints de tumeurs malignes hématologiques ou chez les greffés de moelle osseuse est associée à un risque significativement accru de mucormycose invasive . Ceci est particulièrement vrai chez les diabétiques et les malnutrisants. développer des infiltrats pulmonaires ou de la sinusitePas d’antécédents cliniques complètement spécifiques pour le diagnostic de mucormycose invasive. Cependant, il existe plusieurs exemples de manifestations cliniques initiales qui, chez l’hôte proprement dit, présentent une valeur prédictive potentiellement élevée chez un patient diabétique, en particulier chez un patient diabétique. être hyperglycémique ou cétogène acidose, signifie généralement l’implication des muscles extraoculaires des nerfs innervant les muscles extraoculaires Hyperglycémie chez les patients diabétiques peut également produire une vision trouble mais ne produit généralement pas de diplopie mucormycose invasive, en particulier impliquant le sinus ethmoïde, peut enfreindre la lamina papyracea et envahir la médiane muscle rectus ou il peut s’étendre le long des veines émissaires vers les sinus ethmoïdes et caverneux, empiétant sur les nerfs crâniens III, IV, V, et VI Ainsi, la diplopie chez un patient diabétique doit être évaluée agressivement pour une mucormycose invasive possible. La douleur pleurale dans un hôte neutropénique peut signifier un champignon filamenteux angioinvasive, dont le plus commun peut être Aspergillus fumigatus. Cependant, la mucormycose invasive peut également être un marqueur sentinelle précoce de la mucormycose invasive. être associé à une douleur pleurétique Autres manifestations cliniques Les lésions cutanées nécrotiques chez les patients immunodéprimés peuvent également être causées par une mucormycose. La plupart des cas de mucormycose cutanée sont associés à une inoculation directe plutôt qu’à une hématogenèse. diffusion Le diagnostic différentiel comprend les infections causées par d’autres agents pathogènes angioinvasifs, tels que Aspergillus, Fusarium, Pseudallescheria et Scedosporium espèce Pseudomonas aeruginosa et parfois les organismes Enterobacteriaceae provoquent également ecthyma gangrenosum qui peut ressembler à la mucormycose cutanée. Une biopsie et un dépôt humide de tissu peuvent révéler caractéristique structures hyphales Comme une plus large mesure de sensibilisation dans la communauté médicale, la reconnaissance précoce des facteurs de l’hôte et des manifestations cliniques peut être améliorée grâce à une formation et une éducation adéquates, y compris des publications, des symposiums et des bourses spécialisées. Les directeurs de laboratoire et les technologues en microbiologie, ainsi que l’augmentation du nombre de médecins spécialisés en mycologie clinique, renforceront probablement l’expertise institutionnelle dans le diagnostic de la mucormycose.

ÉLARGISSEMENT DU RÔLE DE L’IMAGERIE DIAGNOSTIQUE

La détection précoce des lésions pulmonaires ou sternales par TDM a été une avancée majeure par rapport aux radiographies conventionnelles des sinus et du thorax. Il faut savoir que chez les patients neutropéniques, le développement des infiltrats pulmonaires signifie déjà lésion tissulaire, angioinvasion, thrombose, nécrose, hémorragie et œdème pour les immunodéprimés. patients, qui présentent un risque élevé de mucormycose pulmonaire invasive, les premières tomodensitométries peuvent révéler des lésions pulmonaires ou sina- les, en l’absence de résultats radiologiques dans les radiographies conventionnelles, avant même la localisation des symptômes. exposition associée au scanner L’exposition aux rayonnements associée à la TDM en série est particulièrement préoccupante chez les enfants, chez lesquels le mSv est administré pour chaque tomodensitométrie thoracique Les tomodensitogrammes sont capables de détecter les lésions plus typiquement associées aux champignons filamenteux angioinvasifs. inclure des nodules, des signes de halo, des auréoles inversées ignites, cavités, infiltrats en forme de coin et épanchements pleuraux associés à la douleur pleurétique Ces lésions sont en corrélation avec les organismes angioinvasifs, notamment Aspergillus spp, Scedosporium spp, Fusarium spp, Mucorales et P aeruginosa. En outre, la mucormycose pulmonaire invasive peut être associée à un large éventail de manifestations précoces, y compris la bronchopneumonie, en particulier chez les patients immunodéprimés non neutropéniques. En outre, les lésions de mucormycose pulmonaire peuvent varier au cours du temps et peuvent inclure de petits nodules précoces, qui peuvent devenir confluents pour former une bronchopneumonie; nodules pulmonaires solitaires plus discrets; et cavitation avec épanchement pleural Bien que la reconnaissance des facteurs de risque, des manifestations cliniques et des résultats radiologiques puisse augmenter la probabilité d’une reconnaissance précoce, un diagnostic définitif doit être établi par culture et biopsie

EXAMEN DIRECT DU TISSU INFECTÉ, DU FLUIDE DE LAVAGE BRONCHOALVÉOLAIRE ET D’AUTRES FLUIDES STÉRILES

Les symptômes, les signes et les manifestations radiographiques de la mucormycose ne sont pas spécifiques et un diagnostic définitif nécessite l’identification directe des hyphes caractéristiques ou la récupération de l’organisme en culture à partir d’échantillons prélevés sur le site de l’infection. lavage broncho-alvéolaire Le liquide BAL est fréquemment non diagnostiqué, mais l’isolement des organismes Mucorales de tels spécimens chez un hôte sensible avec des manifestations cliniques correspondantes doit être considéré à priori comme une preuve irréfutable d’infection L’établissement d’un diagnostic de mucormycose pulmonaire peut également révéler des infections concomitantes. autres organismes, y compris Aspergillus spp et d’autres pathogènes fongiques

Tableau Laboratoire Méthodes de détection et de diagnostic de la mucormycose Examen direct Monture humide Calcofluor Examen cytopathologique Coloration acide périodique-Schiff Gomori méthénamine colorée à l’argent Examen histopathologique Coloration périodique acide-Schiff Gomori méthénamine coloration à l’argent Analyse immunohistochimique Culture Détection antigène Méthodes moléculaires Séquençage direct de l’organisme en culture ou du formol Tissu fixe Hybridation fluorescente in situ PCR quantitative de sang, de liquide BAL ou de tissu Examen direct Humide Calcofluor Examen cytopathologique Coloration périodique acide Schiff Gomori méthénamine colorant argentique Examen histopathologique Coloration périodique acide Schiff Gomori méthénamine coloration à l’argent Analyse immunohistochimique Culture Détection d’antigènes Méthodes moléculaires Séquençage direct d’organismes cultivés ou de tissus fixés au formol Hybridation fluorescente in situ PCR quantitative de sang, de liquide BAL ou de tissu Abréviations: BAL, lavage broncho-alvéolaire; PCR, réaction en chaîne de la polyméraseView LargeSamples pour la microscopie directe par sondage humide, cytopathologique ou histopathologique peut être prélevé par aspiration percutanée guidée radiographiquement et par biopsie transbronchique ou directe des lésions. L’examen histopathologique est spécifique et établit de manière fiable le diagnostic de mucormycose dans la plupart des cas L’examen microscopique direct est effectué sur tous les matériaux envoyés au laboratoire clinique. Dans la mesure du possible, les liquides biologiques et les liquides corporels stériles doivent être soumis à un examen par le laboratoire de biopsie. Laboratoires de microbiologie clinique et de cytopathologie Les hyphes de Mucorales sont généralement de large diamètre, – μm, en forme de ruban et de forme irrégulière, non cénocytiques ou faiblement cloisonnés, avec des branches qui apparaissent souvent de façon non perpendiculaire à «angle droit». les hyphes peuvent être difficiles à observer sur un support humide d’hydroxyde de potassium non amélioré et peuvent ne pas bien se colorer avec la coloration Gram conventionnelle. L’utilisation de colorants liant la chitine, comme le calcofluor, le fungi-fluor ou le blancofluor, peut être utilisée avec un microscope fluorescent. McDermott et ses collègues ont récemment rapporté l’utilisation de tissus colorés au calcofluor comme une technique rapide pour le diagnostic peropératoire et l’évaluation des marges réséquées propres au lieu de coupes congelées par pathologie Les organismes mucorales sont habituellement morphologiquement distinguables de d’autres champignons filamenteux, tels que Aspergillus spp, Fusarium spp et Pseudallescheria boydii, qui apparaissent typiquement comme des hyphes cloisonnés dichotomiquement minces Une distinction par examen direct peut permettre le traitement de l’amphotéricine B et d’autres interventions thérapeutiques potentiellement vitales. , cependant, que dans certains cas, en particulier où moule-active la le rapy a commencé avant la biopsie, les caractéristiques morphologiques peuvent être atypiques, réduisant la capacité de différencier définitivement les espèces Mucorales des autres champignons filamenteux. La détection histologique des organismes Mucorales dans les tissus et leur interprétation peut être difficile. Ces organismes sont généralement difficiles à observer. d’autre part, les taches d’argent périodiques Schiff et Gomori methenamine peuvent être utilisées pour une apparence complètement caractérisée de l’organisme. Malheureusement, seuls des fragments peuvent être observés, même avec l’utilisation de la coloration de la paroi cellulaire. d’hybridation fluorescente et in situ ou de réaction en chaîne par polymérase in situ La PCR peut également être utilisée pour caractériser et distinguer des genres dans l’ordre de Mucorales Hayden et ses collègues ont développé et appliqué l’hybridation in situ pour la caractérisation des champignons filamenteux. rapide et précoce la détection de la mucormycose, mais entre autres méthodes, comme l’immunohistochimie, reste à l’étude en ce moment. D’autres travaux sur l’optimisation, la standardisation et la validation de ces tests pour les tissus, les préparations cytologiques et le BAL sont justifiés. sont expérimentales mais en cours de développement actif

CULTURE DE MUCORALES MÉDICAMENTEUSES

L’identification des organismes Zygomycètes au genre et à l’espèce reste basée sur la morphologie coloniale et microscopique La plupart des zygomycètes médicalement importants sont thermotolérants et peuvent croître rapidement à des températures de ≥ ° C. Les espèces zygomycètes poussent rapidement sur pratiquement tous les substrats hydrates de carbone. Les membres de l’ordre des Mucorales sont identifiés au niveau du genre ou de l’espèce en fonction de la morphologie coloniale, de la morphologie microscopique et de la température de croissance. Caractérisation microscopique des hyphes, des rhizoïdes et des columelles non réagencés. , sporanges et sporangiospores aident à définir le genre et l’espèce dans l’ordre des Mucorales Parce qu’une description taxonomique détaillée des organismes Mucorales dépasse le cadre de ce chapitre, le lecteur est renvoyé à une revue plus approfondie par le Dr June Kwon- Chung dans ce supplément Rhizopus oryzae est le single le plus souvent rapporté espèce Rhizopus Rhizopus rhizopodiformis et Rhizopus microsporus Après le genre Rhizopus, le genre Mucor dans cette étude était le deuxième Rhizopus spp le plus communément rapporté et les espèces Mucor sont ensuite suivies par Cunninghamella bertholletiae, Apophysomyces elegans et Lichtheimia corymbifera auparavant. Absidia corymbifera et Mycocladus corymbifera dans la fréquence de signalement L’identification des organismes Mucorales au niveau du genre ou de l’espèce a des implications épidémiologiques, thérapeutiques et pronostiques précieuses Par exemple, R oryzae est le zygomycète le plus commun récupéré des échantillons cliniques mais tend à présenter une résistance in vitro au posaconazole; Mucorcircinelloides est moins fréquemment isolé, mais montre une plus grande sensibilité au posaconazole. Cunninghamella a tendance à avoir des concentrations inhibitrices minimales plus élevées pour l’amphotéricine B et une mortalité globale associée plus élevée A elegans est associé à l’inoculation traumatique, en particulier dans les climats arides. inoculés sur des milieux appropriés, tels que Sabouraud glucose agar, et incubés à température ambiante et ° C. Le broyage ou l’homogénéisation des spécimens tissulaires peuvent détruire les hyphes délicats, rendant les résultats de culture négatifs. La culture est améliorée si le tissu est tranché ou émincé en petits morceaux. inoculation sur les médias Une collaboration étroite entre les cliniciens et le laboratoire de microbiologie est essentielle pour assurer une manipulation correcte du spécimen. Bien que les espèces de Mucorales soient angioinvasives, les résultats d’hémocultures sont rarement positifs, à moins qu’il n’y ait une atteinte luminale d’un cathéter vasculaire. La susceptibilité antifongique des espèces de Mucorales peut être réalisée rapidement avec des concentrations minimales inhibitrices reproductibles à – heures, telles que mesurées par le test XTT, des résultats parallèles aux heures obtenues par les étalons cliniques et de laboratoire. Méthodes d’institut Les colonies apparaissent généralement en moins de quelques heures sauf si des agents antifongiques résiduels, tels que l’amphotéricine B, peuvent inhiber la croissance. L’apparence coloniale et le mode de croissance en culture aident à distinguer les Mucorales des Entomophthorales. Les colonies se séparent facilement de la surface de la gélose Par comparaison, – jours après l’inoculation avec des organismes Entomophthorales, les colonies sont de couleur grise à jaune pâle, plats et cireux, adhèrent à la surface de la plaque, et ont souvent des bosquets radiaux Il n’y a actuellement pas d’acide nucléique biochimique ou des moyens sérologiques pour aider à la détermination des espèces dans les opérations de routine des laboratoires de microbiologie clinique

DIAGNOSTIC MOLÉCULAIRE DE LA MUCORMYCOSE

De plus, la discrimination entre les caractéristiques histologiques des organismes zygomycètes et ceux d’autres champignons filamenteux peut ne pas être claire. Compte tenu de l’augmentation du nombre de ces infections au cours des dernières années, les approches moléculaires pour la détection des espèces Mucorales importantes Les études ont montré que l’identification moléculaire de la zygomycose est précise, en utilisant la région ITS espacée transcrite interne comme une cible de séquençage de première ligne pour l’identification des organismes zygomycètes en culture pure Récemment , chez un patient atteint de leucémie myéloïde chronique et de greffe de moelle osseuse, R oryzae a été identifié à partir de cultures sinusales par séquençage de l’ITS du gène ARN ribosomique établissant le diagnostic de mucormycose invasive Notre laboratoire a développé des tests qPCR PCR quantitatifs en temps réel, ciblant le gène de l’ARN ribosomal S, pour le dia Les amplicons du premier test qPCR qPCR- des espèces Rhizopus, Mucor et Rhizomucor ont été distingués par l’analyse de la courbe de fusion Le deuxième test qPCR qPCR- a détecté les espèces Cunninghamella, en utilisant des espèces de Cunninghamella et des espèces Rhizopus, Mucor, Rhizomucor et Cunninghamella. Un ensemble différent d’amorces-sondes Pour les deux dosages, la sensibilité analytique pour la détection des éléments hyphalogènes des sporangiospores en germination dans le fluide BAL et les homogénats de tissu pulmonaire chez les lapins était – sporangiospores / mL Quatre modèles uniques et cliniquement applicables de zygomycose pulmonaire invasive servaient de substituts des infections humaines. , facilitant la validation de ces tests pour une utilité diagnostique potentielle Pour qPCR-, des échantillons de poumon infarctus étaient positifs par qPCR et négatifs par culture quantitative Aucun n’était positif seulement à la culture quantitative Parmi les échantillons de liquide de BAL, tous étaient positifs par qPCR, et étaient positifs par quantitative culture qPCR- a démontré l’ADN de Rhizopus et de Mucor en% de échantillons de plasma rial dès le lendemain de l’inoculation Des propriétés similaires ont été observées pour qPCR-, qui a montré une plus grande sensibilité que la culture quantitative dans le liquide de BAL% vs%; P =; n = Le test a détecté l’ADN de Cunninghamella en% des échantillons plasmatiques en série dès le lendemain de l’inoculation. Comme ces tests qPCR sont sensibles et spécifiques pour la détection des espèces Rhizopus, Mucor, Rhizomucor et Cunninghamella dans des modèles animaux cliniquement applicables, ils peuvent être applicables. l’étude et la détection de la mucormycose invasive chez les patients Les méthodes basées sur le polymorphisme de longueur des fragments de restriction PCR ciblant le gène ribosomique S des organismes zygomycètes sur l’ADN extrait d’échantillons humains peuvent également fournir aux cliniciens un diagnostic rapide et définitif de la mucormycose. On a trouvé que des échantillons de tissus inclus dans la cire de paraffine ciblant l’ADN ribosomique S des espèces Zygomycètes permettaient le diagnostic histopathologique de la zygomycose. Un ADN fumigatus a été identifié dans un cas diagnostiqué histopathologiquement comme zygomycose Une étude récente de la reproductibilité interlaboratoire des diagnostics moléculaires de R oryzae, R microsporus, L cor ymbifera, Rhizomucor pusillus et Mucor circinelloides dans des tissus rénaux et cérébraux fixés à la paraffine et fixés au formol chez des souris ont démontré une reproductibilité de% dans le séquençage ITS pour l’identification des espèces de Zygomycètes Après amplification PCR, la région ITS a été amplifiée avec les amorces universelles fongiques ITS et ITS et ensuite séquencés Notamment,% des spécimens infectés par M circinelloides ont donné des résultats négatifs; Ainsi, cette espèce a été exclue de l’étude Dans un rapport récent de mucormycose invasive pulmonaire et d’aspergillose chez un receveur d’une transplantation rénale âgé d’un an, A fumigatus a été initialement identifié à un examen cytologique et à une culture de BAL. a confirmé les résultats de l’analyse histologique du tissu pulmonaire à la fois de l’aspergillose et de la mucormycose Le diagnostic moléculaire de la mucormycose invasive est faisable et justifie d’autres résultats. Le diagnostic précoce de la mucormycose est devenu de plus en plus important, car l’incidence de la maladie a augmenté et de nouvelles modalités de traitement sont devenues disponibles. Dans une large mesure, les options diagnostiques restent limitées aux résultats cliniques et radiologiques, ensemble avec coloration et culture Bien que ces méthodes soient extrêmement utiles, leur sensibilité, leur temps de détection et leur capacité à fournir des résultats sont limités. Des techniques de diagnostic moléculaire plus récentes, notamment l’hybridation in situ et la PCR, sont prometteuses. le résultat dans cette population de patients gravement malades

Remarques

Supplément de parrainage

Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé «Avancées contre la mucormycose: un hommage à la mémoire et le courage de Hank Schueler», parrainé par le Henry Schueler & amp; Fondation

Conflits d’intérêts potentiels

TJW a reçu des subventions de Novartis et d’Astellas et a été consultant pour Trius, iCo, Sigma Tau, Draius et Novartis DK a siégé aux conseils d’administration de Schering Plough et Merck en tant que consultant. Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel. Les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués