Épidémiologie moléculaire de Blastomyces dermatitidis

L’inhalation de conidies de Blastomyces dermatitidis, un champignon trouvé dans le sol, provoque des maladies chez les humains et les animaux. Nous avons étudié la diversité génétique de ce pathogène en extrayant les levures ADN et en les analysant avec une réaction en chaîne par polymérase. analyse des fragments de restriction des amplicons des régions entre les répétitions de l’ADNr et nous a permis de classer les isolats en groupes principaux Les souches ont été différenciées en utilisant des empreintes PCR avec différentes amorces Cinquante-neuf isolats recueillis au fil des ans des régions États-Unis, Inde, Afrique, Canada ont été analysés Les groupes génotypiques A, B et C contenaient, et isolaient, qui étaient divisés en, et types, respectivement. Tous les isolats d’Amérique du Nord du groupe A provenaient du haut ouest des États-Unis ou du Canada, tandis que des isolats du sud-est États-Unis étaient dans le groupe A des études de la plus grande collection de la région Eagle River, WI, a révélé que le sol iso Ltes étudiés n’étaient pas responsables de la majorité des cas dans cette épidémie, comme précédemment proposé, et que & gt; Dans l’ensemble, ces résultats fournissent un outil pour l’étude épidémiologique de la blastomycose et éclairent la diversité génétique et géographique de cet important agent pathogène.

Blastomyces dermatitidis est un champignon dimorphique thermiquement qui produit des mycéliums et forme des aleurioconidies à ° C; en ° C il prend la forme d’une levure bourgeonnante à base large Cet organisme est ascomycète et a une forme sexuelle téléomorphe, Ajellomyces dermatitidis, trouvée dans les microfocaux enrichis en excréments animaux Elle est isolée du sol avec une répartition géographique qui chevauche celle d’Histoplasma capsulatum La maladie humaine est contractée par inhalation de conidies, ce qui provoque une infection pulmonaire locale, souvent accompagnée d’une dissémination extrapulmonaire. Il a été démontré que B dermatitidis n’est pas transmissible d’une personne à l’autre. et otaries Le but de la présente étude était d’évaluer la parenté génétique des isolats de B dermatitidis collectés sur une période d’un an. Nous avons examiné une collection d’isolats bien caractérisés de cet organisme provenant des États-Unis et d’isolats représentatifs de l’Inde. Afrique; ils comprenaient ceux provenant d’épidémies connues Il s’agit de l’étude la plus vaste et la plus diversifiée géographiquement de cet organisme à ce jour

Matériaux et méthodes

Souches Les souches de B dermatitidis étudiées comprenaient des isolats d’éclosions et des cas sporadiques de blastomycose sur une période d’un an. Des souches supplémentaires ont été obtenues auprès de l’American Type Culture Collection à Rockville, MD pour inclusion dans cette étude chikungunya. méthodes communes suivantes: conversion de forme thermique et examen morphologique , inoculation d’animaux , sonde d’ADN , test d’exoantigène , coloration d’anticorps fluorescents Tableau énumère l’origine des souches analysées, divisées en localisations épidémiologiquement apparentées, et le nombre d’isolats de chacun de ces lieux

Les amorces TS et ITS Probe pour NS, ‘-GTAGTCATATGCTTGTCTC-‘, et NS, ‘-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-‘ s’étendent des extrémités ‘à’ de l’ADN ribosomique et incluent la majorité des amorces de sonde S-ADNr pour ITSRC, ‘-GCATATCAATAAGCGGAGGA – ‘, et BDSRC,’ -GTCGAAACCGACG-CTGGCCC- ‘s’étendent des extrémités’ aux extrémités ‘de l’ADNr de S et comprennent la majorité des amorces de sonde S-ADNr pour BDS,’ -GGGCCAGCGTCGGTTTCGAC- ‘, et NS,’ -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC Cette sonde de grande taille a incorporé l’ADN ribosomique et les grandes régions intergéniques entre les sondes marquées à répétition de l’ADNrDigoxigénine ont été générées par PCR avec des paires d’amorces spécifiques par utilisation. d’un mélange PCR Dig-Labeling Boehringer Mannheim de nucléotides, qui aboutit à l’incorporation de dUTP marqué à la digoxigénine dans l’ADN des amplicons a été amplifié dans le tampon fourni par le fabricant du système de PCR Expand High Fidelity PCR; Boehringer Mannheim dans un volume -μL contenant des amorces μM, Mg MgCl, U de l’ADN polymérase, μM dATP, μM dCTP, μM dGTP, μM dTTP, et μM digoxigénine-marqué dUTP Les réactions ont été réalisées en utilisant un cycleur thermique automatique GeneMate; Lab-Line Instruments, Melrose Park, IL Les échantillons d’ADN ont été dénaturés par incubation pendant min à ° C. Ceci a été suivi de cycles de ° C pour min, ° C pour min, et ° C pour min, suivis de cycles de ° C pour min. , ° C pour min, et ° C pour min, avec une addition de s pour chaque allongement par cycle La PCR a été complétée avec une étape finale d’élongation de min à ° C L’ADN amplifié a été purifié au moyen d’un kit disponible dans le commerce. ; Promega, Madison, WI Les ADN amplifiés ont été utilisés comme sondes pour l’hybridation sur les transferts de Southern. PCR Les amorces pour cette PCR étaient les mêmes que celles utilisées pour la génération de la sonde utilisée dans les Southern blots ci-dessus, ce qui a entraîné des amplicons. de l’ADN ribosomique à la fin de l’ADN S-ADNm a été amplifié à forte stringence dans le tampon fourni par le fabricant de l’ADN polymérase Expand Système PCR High Fidelity dans un volume -μL contenant des amorces μM, Mg MgCl, U de l’ADN polymérase , μM dATP, μM dCTP, μM dGTP et μM dTTP Les réactions ont été réalisées avec un thermocycleur automatique GeneMate Les paramètres de température et de cycle temporel pour la PCR étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus pour la génération de sondes pour Southern blot. a été purifié par un kit commercial Wizard PCR Preps Dix microlitres de l’amplicon résultant ont été digérés avec des endonucléases de restriction à la température recommandée pendant la nuit L’endonucléase de restriction Les fragments d’ADN ont été séparés à travers un gel d’agarose% wt / vol dans du tampon TAE pour h à V / cm et visualisés par transillumination aux ultraviolets après coloration au bromure d’éthidium. Pour subdiviser davantage les groupes génotypiques, on a utilisé une méthode PCR d’ADN polymorphe amplifié au hasard comme décrit ailleurs Les amorces les plus discriminantes décrites dans cette étude ont été utilisées séquence promoteur SP, ‘-ATTTAGGTGACACTATAG-‘, séquence inverse M / pUC, ‘ -AGCGGATAACAATTTCACACAGG- ‘, et l’amorce « histo », -AAGCTTGCATTTGTGTTCCTTGATAAGTG- Les concentrations des constituants et le profil de cycle de température de la méthode d’empreinte PCR étaient identiques à ceux décrits ailleurs Les produits de PCR résultants ont été séparés par un% wt / vol gel d’agarose dans du tampon TAE pour h à V / cm et visualisé par transillumination aux ultraviolets après coloration au bromure d’éthidiumDigital im Les images de la bande d’ADN ont été analysées à l’aide du logiciel BioImage AQ. Les patrons de bande d’ADN pour chacune des souches ont été analysés à l’aide d’une caméra CCD à dispositif à transfert de charge et du système de documentation sur gel BioImage AQ BioImage, Ann Arbor, MI ont été appariés pour les pourcentages de similarité par la méthode Dice avec une tolérance% interbandes Des dendrogrammes ont été générés à partir de cette analyse par la méthode des groupes de paires non pondérés avec la méthode de la moyenne arithmétique Les souches ayant une similitude & gt; Les empreintes digitales PCR ont été réanalysées après une séparation côte à côte sur le même gel d’agarose pour confirmer leur identité. Les souches présentant une similarité de & lgr;% par utilisation de cette méthode ont été considérées comme uniques Par conséquent, les souches ont été initialement divisées en grands groupes génotypiques. et ensuite divisé en types pour les souches qui étaient identiques par PCR avec différentes amorcesPour évaluer la stabilité des génotypes de PCR, au hasard cho Les souches V, Gu et En ont été cultivées en mL de bouillon d’infusion cerveau-cœur et incubées à ° C dans un incubateur à secousses. Approximativement tous les jours, les cellules par millilitre ont été déterminées et un échantillon a été inoculé dans du bouillon frais. un ADN de doublage estimé a été extrait de l’inoculum initial et final, et les empreintes digitales PCR générées par toutes les amorces ont été comparées

Résultats

Génotypage La méthode RFLP génomique utilisée nous a permis de distinguer les souches en grands groupes génotypiques. Cependant, une difficulté considérable a été rencontrée pour extraire suffisamment d’ADN chromosomique de bonne qualité de toutes les souches étudiées. De plus, l’interprétation des différences mineures observées n’a pas été permettre la confiance dans cette méthode Le degré élevé de similitude des RFLP de l’ADN génomique dans toutes les souches étudiées et avec toutes les enzymes de restriction utilisées EcoRI, HindIII, PstI, BglII, CfoI, TaqI et DdeI indique la similarité génétique étroite de tous les B dermititidis On pensait que l’adaptation de la méthode publiée consistant à sonder l’ADNr des RFLP génomiques via des transferts de Southern permettrait une discrimination plus nette entre les souches. Les polymorphismes parmi les souches n’ont pas été révélés par les sondes des sondes répétées à l’intérieur de l’ADNr. le cas de toutes les endonucléases de restriction évaluées. Cependant, des polymorphismes ont été observés Ces polymorphismes étaient plus évidents lorsque les endonucléases de restriction PstI et BglII étaient utilisées. Bien que cela ait abouti à des différences observables et facilement interprétées, le problème d’ADN de longueur chromosomique inadéquate de haute qualité persistait. Les résultats observés pour les polymorphismes avec sonde Les séquences répétées entre ADNr ont été étendues pour évaluer les produits de PCR générés par les mêmes amorces utilisées pour construire la sonde. Un PCR de haute stringence a été réalisé, et des régions de polymorphisme ont été évaluées sur des sites de reconnaissance par endonucléases de restriction. kb Des polymorphismes de ces amplicons ont été observés avec un certain nombre d’endonucléases de restriction; le plus discriminant était le chiffre DdeI. Il en résultait une méthode simple, rapide et facile à interpréter pour diviser les souches en grands groupes génotypiques, qui ne reposaient pas sur une quantité abondante d’ADN de haute qualité. Les groupes auxquels les souches étaient affectées étaient les mêmes quelle que soit la méthode utilisée, la sonde génomique ou la PCR RFLP ont été utilisées. Cependant, la méthode PCR RFLP a permis d’attribuer rapidement de nombreuses souches à des sous-groupes.

Figure Vue largeDownload slidePhotographie des produits de PCR colorés au bromure d’éthidium et ultraviolets transilluminés après électrophorèse dans un gel d’agarose% Les produits ont été digérés avec DdeI, en utilisant les mêmes amorces que celles utilisées pour construire la sonde pour le transfert de Southern à partir de répétitions d’ADNr voir Matériel et méthodes L’ADN de la réaction de PCR a été purifié par le système de purification Wizard PCR Preps avant digestion avec U de l’endonucléase de restriction DdeI. Les amorces ont été conçues de sorte que les amplicons PCR s’étendent de la fin de l’ADNr. du S-ADNm M indique des marqueurs de poids moléculaire; leurs tailles correspondantes en bp sont à gauche Les lettres au-dessus des pistes indiquent des groupes génotypiques -, blank controlFigure View largeDownload slidePhotographie des produits de PCR colorés au bromure d’éthidium, ultraviolets-transilluminés après électrophorèse dans un gel% d’agarose Les produits ont été digérés avec DdeI, avec les mêmes amorces que celles utilisées pour construire la sonde pour le transfert de Southern à partir des répétitions inter-ADNr voir Matériel et Méthodes L’ADN de la réaction de PCR a été purifié d’abord par le système de purification Wizard PCR Preps avant digestion avec U de l’endonucléase de restriction DdeI. de sorte que les amplicons de PCR s’étendant de la fin de l’ADNr de S à l’extrémité du SADM M indiquent des marqueurs de poids moléculaire; leurs tailles correspondantes dans bp sont à gauche Les lettres ci-dessus indiquent des groupes génotypiques -, des ADN témoins blancs provenant d’isolats de B dermatitidis qui avaient été utilisés dans une étude précédente ont été mis à disposition par E Keath PCR Les analyses RFLP ont montré qu’ils étaient séparables dans le mêmes grands groupes génotypiques qui ont été décrits ailleurs , qui ont confirmé la reproductibilité et l’utilité de la méthode PCR RFLP de chaque souche a été faite plusieurs fois avec chacune des amorces avant que cette souche ne soit identifiée avec une autre ou plusieurs souches. Les dendrogrammes générés par l’analyse ont été utiles dans la classification de ces souches Cependant, avant l’attribution de l’identité finale, les souches ont toujours été analysées après des séparations côte à côte, pour permettre des comparaisons visuelles de leur similarité.

Figure Vue grandDownload slidePhotographies d’empreintes digitales de PCR colorées au bromure d’éthidium, colorées en ultraviolet d’une sélection représentative d’isolats dont l’ADN a été amplifié en utilisant la séquence A du promoteur SP et l’amorce « histo » B décrite ailleurs Les souches ne sont pas dans le même ordre dans chaque gel Les désignations génotypiques sont indiquées au-dessus des voies: groupe génotypique A, B ou C, type génotypique -, et variant x, y ou z; voir tableau M indique les marqueurs de poids moléculaire; leurs tailles correspondantes dans bp sont à gauche -ve, contrôle blancFigure View largeDownload slidePhotographies d’empreintes digitales de PCR colorées au bromure d’éthidium, ultraviolettes-transilluminées d’une sélection représentative d’isolats, dont l’ADN a été amplifié par l’utilisation de la séquence A du promoteur SP et « Amorce B, comme décrit ailleurs Les souches ne sont pas dans le même ordre dans chaque gel Les désignations génotypiques sont indiquées au-dessus des pistes: groupe génotypique A, B ou C, type génotypique -, et variant x, y ou z; voir tableau M indique les marqueurs de poids moléculaire; leurs tailles correspondantes dans bp sont à gauche -ve, témoin blancN’entreposage d’un isolat, avec la préparation de l’ADN à différents moments après le stockage, ni la préparation de l’ADN de différents lots de cellules d’un isolat a entraîné des changements suffisants pour classer les différentes préparations De plus, les variantes morphologiques des colonies d’un seul isolat étaient identiques par cette méthode. Les groupes génotypiques et les types auxquels les souches étaient affectées sont listés dans le tableau Les souches appartenant au même type au sein du même groupe avaient un profil d’empreintes digitales PCR qui était identique pour chacune des amorces utilisées. Cependant, il y avait des exceptions mineures pour les souches du groupe A, type ie, F, F et B, et des souches dans le groupe B, type ie, et, identité avec les autres et membres de la même classe dépendait de l’amorce de l’empreinte PCR utilisée. Par exemple, la souche F est identique à F avec l’utilisation de l’amorce SP , et ces souches diffèrent de B seule la bande F est identique à B lorsqu’elle est testée avec la seconde amorce MPuc , mais diffère de la souche F par bande. La troisième amorce H a montré que toutes les souches étaient identiques De même, les souches groupe B, type, avec utilisation de l’amorce SP et de l’amorce MPuc, respectivement. L’amorce H a montré que toutes les souches du groupe B, type, avaient des empreintes digitales identiques.

Tableau View largeDownload slideRésultats du typage moléculaire des isolats de Blastomyces dermatitidis collectés sur une période de tempsTable View largeTélécharger les résultats du typage moléculaire des isolats de Blastomyces dermatitidis collectés sur une période de tempsLa stabilité des génotypes a été testée par des isolats passants in vitro Trois isolats ont été On a comparé les isolats avant et après le passage. Les paires d’isolats ont été identiques par PCR avec des amorces différentes. Épidémiologie En utilisant cette méthode, nous avons analysé les isolats de B dermatitidis à partir des régions des États-Unis, des régions, des isolats; L’Inde, isole; L’Afrique, s’isole; et Canada, isolat recueilli sur une période de plusieurs années Plusieurs autres isolats de B dermatitidis ont été mis à notre disposition pour analyse, mais malheureusement ces isolats n’ont pu être cultivés ou n’ont pas pu être convertis de l’hyphes à la levure pour une étude plus approfondie. isolats contenus subdivisés en types table; A-A, groupe B contenait des isolats subdivisés en types table; B-B, et le groupe C contenait des isolats subdivisés en une table de types; C-CAnalyse de ces résultats a révélé que tous les isolats des patients et du sol en Amérique du Nord qui appartenaient au groupe génotypique A ont été isolés d’une zone géographique contiguë du haut ouest des États-Unis et du Canada, alors qu’aucune des souches du sud-est Les États-Unis étaient dans ce groupe dans la plus grande collection d’isolats; patients, sol étudié qui ont été cultivés à partir de la région Eagle River, Wisconsin ; des isolats étaient disponibles chez des patients non inclus dans le rapport original, les patients avaient des isolats génotypiquement indiscernables groupe A, type Un autre isolat de patient était également dans ce groupe groupe A, type Deux paires de patients avaient des isolats indiscernables avec groupe B, type, isolats et le groupe C, le type, les isolats et les isolats des patients étaient indiscernables d’un isolat environnemental du même groupe local C, le second isolat environnemental de type A de ce lieu était différent de toutes les autres souches étudiées dans ce groupe de sites B, type sont apparents Ils suggèrent que la distribution des types n’est pas aléatoire dans le domaine de l’endémicité Par exemple, des isolats de Caroline du Sud sont du groupe B, et parmi ceux-ci sont du même type B, le type Deux de ces isolats provenaient d’un groupe de cas associés à Traveller’s Rest, en Caroline du Sud DiSalvo AF, des données non publiées, et les deux étaient de type B Un autre groupe de cas a été signalés à Oconto Falls, Wisconsin Trois de ces patients avaient des isolats du groupe A et des isolats du groupe C et pas du groupe B Deux des isolats du groupe A étaient du même type Trois isolats de patients provenaient de Chicago et appartenaient tous au groupe B; cependant, un lion de mer du Brookfield Zoo de Chicago avait un isolat du groupe C Huit isolats provenaient de Géorgie, et de ceux du groupe C étaient de type identique Trois isolats de patients ont été obtenus du Mississippi et tous étaient du même type Deux des isolats de l’Inde, patients et chauves-souris, étaient indiscernables les uns des autres et différaient de tous les autres. Un isolat obtenu du Canada et d’un patient de Louisiane était un type unique. Il y a des contrastes entre ces associations; par exemple, tous les isolats africains appartenaient à des groupes différents. Cependant, tous provenaient de régions très éloignées: isolats de Rhodésie B, Zaïre B et Afrique du Sud B Les isolats du Minnesota et du Kentucky appartenaient à différents groupes. artificiel par rapport à la géographie de la terre; isolats provenant du même état où la localisation spécifique de l’infection est inconnue peuvent représenter une plus grande distance géographique que les isolats des états adjacents et un isolat d’un patient en état peut représenter une infection acquise lors d’un précédent voyage vers un autre état. était d’un patient traité à Chicago qui était un résident à long terme d’Elgin, Illinois, qui est juste à l’extérieur de Chicago, mais aussi à quelques miles de la frontière du Wisconsin Certains types apparaissent également largement dispersés sur la zone d’endémicité; par exemple, le cas extrême, le groupe B, le type, les isolats ont été trouvés dans des endroits couvrant le Midwest et le sud-est des États-Unis

Discussion

stockage dans le passage froid ou série in vitro et que cette perte de virulence n’a pas été restaurée par un passage in vivo en série Le développement récent d’un système de transformation chez B dermatitidis constitue une avancée significative dans notre capacité à étudier les mécanismes par lesquels cet organisme cause la maladie. Il serait logique d’explorer les mécanismes génétiques de la virulence chez les souches bien caractérisées virulentes et leurs mutants avirulents spontanés; cependant, la parenté de ces organismes doit être établie en premier Pour évaluer cela, la souche bien caractérisée ATCC, initialement désignée SCB-, isolée et montrée à plusieurs reprises virulente dans de nombreuses études in vivo , a été incluse dans cette étude, comme cette souche ATCC mutante avirulente tout aussi bien caractérisée Bien que ces souches fussent dans le même groupe génotypique B, chacune des méthodes d’analyse utilisées présentait des empreintes PCR différentes. Il se pourrait bien que des changements génétiques importants aient provoqué cette souche perdre la virulence ATCC, et ces changements sont reflétés dans les empreintes digitales PCR variables entre les dérivés de cette souche La dérive génétique , les changements associés à la commutation phénotypique coloniale , et l’infection par un virus sont peut-être les meilleures explications résultats Il est nécessaire d’étudier plus avant la relation entre les souches qui ont été stockées pendant de longues périodes et leurs dérivés afin de La non-identité des isolats apparentés généalogiquement peut expliquer pourquoi les isolats apparentés géographiquement et temporellement se trouvaient parfois dans le même groupe mais pas le même type. Autrement dit, les isolats dans les sols adjacents peuvent avoir été suffisamment divergents pour être typés différemment. expliquer certains de nos résultats: pourquoi les isolats d’Eagle River étaient du groupe A mais pas du type; des isolats du groupe B en Caroline du Sud n’étaient pas de type; des isolats d’Oconto Falls était du groupe A mais pas du type; les isolats de patients de Chicago étaient le même groupe mais pas du même type; les isolats de patients de Géorgie étaient du groupe C mais pas du même type que les isolats de sol de Géorgie qui appartenaient au groupe C; le reste du voyageur isole les deux groupes B de types différents; et des isolats de patients du Mississippi, tout le groupe B était d’un type différent. Il est intéressant de noter que les isolats Ha et Gu avaient également été précédemment groupés, selon un système de typage proposé qui s’appuyait sur un certain nombre de caractéristiques phénotypiques , d’autres isolats MCG- et V dans le même groupe génotypique B sont apparus distincts par phénotypage Deux isolats apparentés généalogiquement dans l’étude ont également été différenciés par des caractéristiques phénotypiques Dans les études d’accouplement de B dermatitidis, il a été montré que seules les espèces existent en Amérique du Nord et que les isolats africains appartiennent également à la même espèce Cela a été confirmé par une étude récente qui évaluait les profils d’activité enzymatique dans le but de biotyper des isolats cliniques de patients atteints de blastomycose. que de distinguer, les variantes africaines et nord-américaines de B dermatitidis Cependant, des études antérieures qui ont évalué les deux antige nicity et les croisements génétiques ont rapporté que bien que les isolats africains puissent être étroitement apparentés aux isolats nord-américains, ils ne sont pas sans équivoque les mêmes espèces, et des études ultérieures ont conclu qu’il s’agissait d’études de réassociation d’ADN. Les études de génotypage appuient les études qui ont classé les variants ensemble Cependant, beaucoup d’autres isolats non nord-américains doivent être étudiés avant de pouvoir tirer des conclusions sur la distribution génétique globale de cet organisme. la comparaison des isolats de diverses régions, l’utilisation de la méthode PCR RFLP permet la division rapide et précise des isolats en groupes génotypiques larges. Ces groupes génotypiques peuvent représenter une variation importante au sein de l’espèce B dermatitidis, qui pourrait inclure une différence de type d’accouplement, différences dans l’adaptation de l’organisme à différentes niches écologiques, ou peut-être des variations im Une observation intrigante dans la présente étude est l’association d’un groupe d’isolats A avec seulement une partie de la zone contiguë qui délimite la zone géographique d’endémicité de ce champignon en Amérique du Nord La présente étude indique également qu’il existe des zones plus petites Ces résultats fournissent des données sur la spéculation relative à l’importance de la dissémination clonale par rapport à la reproduction sexuée pour cet organisme dans la nature. Cette étude simplifie et vérifie un outil extrêmement sensible pour l’investigation épidémiologique des cas groupés. de la blastomycose et met en lumière la diversité génétique observée avec cet important pathogène fongique

Remerciements

Les contributeurs à la collection de culture ont inclus Norman L Goodman, Arvind A Padhye, John M Besser, et Leslie Stockman Beaucoup de cultures ont été maintenues pour & gt; ans par Miriam S Davis au South Carolina State Laboratory, Columbia, Caroline du Sud