Résistance Triazole haute fréquence trouvée dans Aspergillus fumigatus non cultivable des poumons des patients avec la maladie fongique chronique

Contexte Le traitement par voie orale à base de triazole est bien établi pour le traitement de l’IPA invasif, de l’ABPA allergique et de l’aspergillose pulmonaire chronique chronique, et les taux de résistance au triazole à long terme augmentent souvent à l’échelle internationale. Nous avons évalué la charge fongique respiratoire dans les échantillons de LBA et d’expectorations dans un lavage broncho-alvéolaire. Dans un sous-ensemble d’échantillons positifs pour la PCR, nous avons amplifié le gène CYPA. pour détecter les polymorphismes mononucléotidiques clés SNP associés à la résistance au triazoleRésultats ADN Aspergillus a été détecté dans BAL de volontaires normaux /,% et les patients avec culture ou microscopie confirmée IPA /,% Aspergillus ADN a été détecté dans les expectorations de% et de% patients avec ABPA et CPA, comparé à% et% par culture, respectivement en c ulcère positif, PCR positif, nous avons détecté des mutations de résistance au triazole LH avec répétition en tandem [TR] et M dans la cible CYPA en% d’échantillons Six de% de ceux avec ABPA et de% avec CPA avaient des marqueurs de résistance présents, certains ont été traités sans traitement préalable par le triazole et dans la plupart des cas malgré des concentrations adéquates de médicaments plasmatiques au moment de l’échantillonnage. Les résultats très faibles de l’infection causée par les champignons ont déjà empêché la culture directe et la détection des résistances antifongiques dans les échantillons cliniques. triazoles pour la thérapie antifongique humaine

Aspergillus spp provoque des maladies allant de l’aspergillose pulmonaire invasive IPA chez les patients immunodéprimés à l’aspergillose pulmonaire chronique CPA et les maladies allergiques fongiques, y compris l’aspergillose bronchopulmonaire allergique ABPA et la sévérité accrue de l’asthme asthme sévère avec sensibilisation fongique [SAFS] Des millions d’individus sont touchés dans le monde ou à risque; des estimations récentes indiquent approximativement million de patients avec CPA, million avec ABPA et plus de million avec SAFS L’exposition à des centaines de conidies d’Aspergillus fumigatus est un changement quotidien universel Conidia d’être anergique au système immunitaire humain à produire le plus grand nombre de allergènes documentés de tout autre organisme vivant sur la germination Un traitement antifongique par triazoles est recommandé chez les patients ABPA, CPA et IPA Il existe trois composés triazoliques homologués hautement actifs contre Aspergillus spp-itraconazole, voriconazole et posaconazole . La résistance à la triazole est apparue comme un facteur important limitant la réussite de la résistance à l’Itraconazole chez un isolat de Californie à la fin de l’année. Aux Etats-Unis, Martinez et al ont trouvé une concentration minimale inhibitrice d’itraconazole en CMI ≥ mg / L de% in -, comparé à% in -; et à Detroit, des isolats de% A fumigatus présentaient des CMI élevées chez les triazoles, comparativement à% en Des taux de résistance croissants ont été observés aux Pays-Bas et au Royaume-Uni , avec% de patients atteints de triazole à Manchester isolats résistants L’utilisation extensive des azoles en agriculture est le coupable présumé , avec l’émergence de résistances au cours du traitement documentées La méthodologie actuelle de détection de résistance nécessite une culture positive mais la haute fréquence des cultures négatives limite fortement notre capacité à détecter Le traitement par triazole est donné pendant des années aux patients avec ABPA, SAFS et CPA, habituellement sans risque et efficacement Le développement de la résistance entraîne la perte du contrôle de la maladie Chez ces patients, les cultures sont souvent négatives et plus sensibles. des moyens d’établir la raison de la perte de contrôle de la maladie sont requis Pour des raisons similaires, il est important de choisir la thérapie initiale correcte aussi rapidement que possible pour obtenir de bons résultats s dans IPA avec des taux de mortalité allant d’environ -% avec traitement Des mutations dans le gène CYPA, codant pour la protéine cible azole lanosterol α-déméthylase, sont responsables de la plupart des cas de résistance [,,] altérations structurelles de l’enzyme Les principales mutations de résistance au gène CYPA sont aux codons, et bien que nous et d’autres aient rapporté plusieurs autres mutations [-,,] Un fort biais vers des mutations clés conférant une résistance azole permet une détection moléculaire directe sans culture d’un fumigatus

Méthodes

Traitement des échantillons normaux de BAL volontaires

Tous les volontaires ont donné leur consentement éclairé et l’étude a été approuvée par le comité local d’éthique. Chaque volontaire a subi une bronchoscopie standard et un lavage broncho-alvéolaire BAL Jusqu’à ml de liquide BAL a été centrifugé et les granulés ont été soumis à une extraction d’ADN Myconostica Jusqu’à mL a été centrifugé pour la culture et du culot resuspendu a été strié sur deux plaques de Sabouraud et incubé à ° C et ° C pendant des jours, selon la méthodologie nationale du Royaume-Uni

Traitement des échantillons de BAL d’aspergillose invasive

Tous les échantillons de BAL ont été prélevés chez des patients à risque et infectés dans le cadre d’un bilan diagnostique standard à Innsbruck depuis des années. Tous les échantillons ont été traités prospectivement de la même manière en laboratoire clinique et les échantillons excédentaires conservés pour analyse PCR rétrospective. pour le diagnostic de l’IPA sont compatibles avec les critères EORTC / MSG de l’Organisation européenne pour la recherche et le traitement du cancer / mycoses Culture fongique et microscopie de – mL volume de liquide BAL dépendant de la centrifugation, g, min et remise en suspension en mL de l’échantillon remis en suspension a été inspecté sous microscopie fluorescente avec du Calcofluor. Le reste a été étalé sur des milieux fongiques Sabouraud avec du chloramphénicol, une infusion de coeur et de malt et cultivé à ° C et ° C. Des cultures positives ont été identifiées par des méthodes conventionnelles. avec – μL de liquide BAL L’échantillon résiduel a été stocké à – ° C ou habituellement – ° C prio r à l’extraction d’ADN avec le kit d’extraction d’ADN fongique MycXtra et la PCR en temps réel Toutes les données cliniques ont été anonymisées

Traitement des échantillons d’expectorations

Des échantillons de crachats ont été prélevés chez des patients CPA et ABPA à Manchester. Les patients ont donné leur consentement éclairé. Le diagnostic de CPA était basé sur des données d’anticorps et de radiologie , ABPA sur des données cliniques et sérologiques et SAFS. Pour la culture fongique, la microscopie et l’extraction de l’ADN, les expectorations ont été digérées avec un ratio Sputasol: vortexé et μL strié sur deux plaques de Sabouraud , incubées à ° C et ° C pendant plusieurs jours. immédiatement après la réception des échantillons, en suivant les instructions du kit MycXtra, l’ADN a été élué dans μL de tampon S et μL a été utilisé pour la PCR quantitative qPCR

Aspergillus PCR Assay

Nous avons utilisé le test de diagnostic PCR en temps réel disponible dans le commerce MycAssay Aspergillus Myconostica pour la détection d’Aspergillus spp. Au moins différents Aspergillus spp sont détectés avec le test, y compris les espèces pathogènes les plus fréquentes, et Penicillium spp It utilise des balises moléculaires. le génome de l’ARN ribosomique de l’ARN ribosomique Une séquence de contrôle interne d’origine végétale a été incluse pour détecter les inhibiteurs de PCR dans l’échantillon Sur le Cepheid SmartCycler, la limite d’essai de l’ébauche est un cycle Ct de cycles avec une sensibilité cible des copies S, approximativement le génome, étant donné une plage de copies S par nombre de copies par génome de A fumigatus Le test est marqué CE avec un point final non quantitatif, mais nous avons choisi de l’utiliser de manière quantitative pour évaluer la charge fongique

Détection directe des principales mutations de résistance aux azoles

Comme la quantité d’ADN d’Aspergillus était modeste dans la plupart des échantillons et absente dans les échantillons IPA, une approche PCR nichée a été utilisée pour obtenir une sensibilité maximale. Nous avons partiellement amplifié le gène CYPA dans deux fragments de ~ bp. Les produits amplifiés ont été évalués dans un test en temps réel avec une balise moléculaire allèle-spécifique dirigée sur les SNP polymorphismes mononucléotidiques clés liés à la résistance azole G, promoteur L répétition en tandem [TR], G, et M Tous les résultats ont été confirmés par séquençage d’ADN Les notes des patients ont été examinées pour leur traitement antifongique Les données de résistance n’ont pas été utilisées pour la prise de décision clinique

RÉSULTATS

Extraction de l’ADN d’Aspergillus à partir d’échantillons respiratoires

L’extraction d’ADN fongique suffisant pour la détection moléculaire est l’aspect technique le plus difficile de la PCR pour les champignons. La combinaison de très peu de cellules fongiques dans un échantillon clinique et d’une paroi cellulaire robuste nécessitant une fracture pour la libération d’ADN pose problème. rupture des cellules ouvertes, précédée d’une étape de digestion Dans l’ensemble, le pourcentage d’efficacité des conidies non gonflées a été démontré Figure supplémentaire S

Détection de l’ADN d’Aspergillus chez des volontaires avec PCR

Pour mieux comprendre le syndrome d’Aspergillus dans les poumons d’individus sains, nous avons testé le BAL chez des adultes normaux ayant subi une bronchoscopie. Parmi ceux-ci, des échantillons négatifs ont été détectés dans le test PCR. spp morphologies et Paecilomyces spp Les valeurs de Ct positives vont de à Figure, en cohérence avec Aspergillus spp étant présent dans les poumons normaux

Tableau Aspergillus Culture, qPCR, et A fumigatus Résistance Mutation Détection dans les populations étudiées Résultat du laboratoire ABPA CPA IPA Normales Culture positive pour Aspergillus spp / /% /% / Culture positive pour Un fumigatus / /% /% / qPCR positif pour Aspergillus spp /% /% /% /% Mutation d’un fumigatus CYPA détectée directement à partir d’un échantillon qPCR positif /% /% NTa NTa Résultat du laboratoire ABPA CPA IPA Normales Culture positive pour Aspergillus spp / /% /% / Culture positive pour Un fumigatus / /% /% / QPCR positif pour Aspergillus spp /% /% /% /% Une mutation de fumigation du CYPA détectée directement à partir de l’échantillon qPCR-positif /% /% NTa NTa NOTE qPCR indique une réaction en chaîne par polymérase quantitative; ABPA, aspergillose bronchopulmonaire allergique; CPA, aspergillose pulmonaire chronique; IPA, aspergillose pulmonaire invasive NT indique non testé échantillon insuffisant restantVoir Grand

Figure View largeTaille de chargementCharges d’Aspergillus mesurées par réaction en chaîne par polymérase qPCR dans des échantillons respiratoires de groupes de patients et de groupes spontanés Expectorations spontanées en clinique chez des patients souffrant d’aspergillose bronchopulmonaire allergique ABPA incluant un patient souffrant d’asthme sévère avec sensibilisation fongique et aspergillose pulmonaire chronique FPCP dans des échantillons respiratoires provenant de groupes de patients et de groupes de volontaires Spontum produit spontanément dans une clinique de patients souffrant d’aspergillose bronchopulmonaire allergique ABPA, y compris un patient souffrant d’une forme sévère de l’aspergillose bronchique. asthme avec sensibilisation fongique [SAFS] et aspergillose pulmonaire chronique CPA ont été divisés pour la culture et l’extraction de l’ADN avant qPCR Ct, seuil de cycle

PCR dans l’aspergillose pulmonaire invasive

Nous avons analysé des échantillons de patients avec IPA avec confirmation mycologique Des échantillons,% avaient des hyphes compatibles avec Aspergillus spp visible sur microscopie Tous les% étaient positifs pour un champignon filamenteux, pour A fumigatus, pour A terreus, et pour Penicillium spp, et ont augmenté A niger, Rhizopus oryzae et Lichtheimia corymbifera PCR négatif Cinq des patients présentaient un IPA prouvé et probable dans le contexte de conditions immunodéprimantes typiques, y compris une greffe d’organe n = et une leucémie aiguë. En utilisant les données volontaires normales comme témoins négatifs et une coupe Ct. off, la sensibilité était%, la spécificité%, la valeur prédictive positive% et la valeur prédictive négative% Dix-sept patients% avaient reçu une prophylaxie ou une thérapie antifongique Un ADN d’Aspergillus a été détecté par PCR dans% échantillons Tableau avec des valeurs Ct allant de à Pénicillium était positif à la PCR De plus, dans ces échantillons, la force du signal était généralement beaucoup plus forte que celle de les volontaires normaux, indiquant une plus grande charge d’Aspergillus dans l’IPA que chez les personnes normales

PCR dans l’aspergillose chronique et allergique

Dans les expectorations spontanées de patients ABPA, SAFS et CPA, nous avons détecté l’ADN d’Aspergillus beaucoup plus fréquemment que les cultures étaient positives. Chez les patients ABPA, toutes les cultures étaient négatives malgré une immunoglobuline E fortement positive pour l’ADN d’Aspergillus fumigatus. Parmi les patients atteints de CPA, tous ayant des anticorps IgG anti-Aspergillus détectables et des radiographies pulmonaires extrêmement anormales,% présentaient une culture positive pour A fumigatus et% présentaient un ADN d’Aspergillus détectable par Tableau de PCR Chez les patients avec CPA, des signaux PCR plus forts étaient généralement observés chez ceux avec des cultures positives

Détection directe de la résistance aux azoles

Nous avons sélectionné l’ADN des premiers échantillons d’expectorations obtenus à partir de patients ABPA et CPA positifs à la PCR, positifs à la culture et positifs à la PCR, positifs pour la PCR. Tableau supplémentaire S Aucune mutation G ou M n’a été trouvée Quatre échantillons M mutations: MK et MR cypA substitutions sur le séquençage Vingt-sept des% avaient une mutation LH, et% avaient aussi un bp TR en amont, la combinaison conférant résistance à l’itraconazole et voriconazole Le TR a été trouvé sans mutation LH dans les échantillons Deux échantillons avaient une mutation MR avec les deux mutations TR et LH Des échantillons positifs pour la culture, ont donné des isolats sensibles, et dans l’un de ces échantillons cliniques, aucune mutation de résistance n’a été détectée dans les autres TR LH détectée par criblage moléculaire. était l’itraconazole MIC résistant aux azoles & gt; mg / L, vORiconazole mg mg / L, et posaconazole mg / L, mais aucune mutation de résistance n’a été trouvée dans l’échantillon clinique correspondant à partir duquel cet isolat a été cultivé ou sur le séquençage du gène CYPA de l’isolat Le quatrième isolat était multi-azole -résistant et une mutation MK a été trouvée directement dans l’échantillon clinique et confirmée par le séquençage CYPA de l’isolat. Dans l’ensemble,% des échantillons présentaient des signes de résistance à l’azole et de% d’isolats

Traitement azoïque antérieur et concomitant

Parmi les patients échantillonnés, un CPA a été échantillonné avant le début du traitement et sur le posaconazole, des marqueurs de résistance ont été trouvés en% avec ABPA ou SAFS et de% avec CPA. Le temps d’échantillonnage et l’exposition azole pourraient être utiles pour trouver des marqueurs de résistance; Dans le tableau et le tableau supplémentaire S, ces relations sont montrées Des concentrations plasmatiques faibles ont été observées chez%, des et% des patients prenant l’itraconazole, le posaconazole et le voriconazole respectivement, mais beaucoup avaient déjà reçu un traitement. des conclusions autres que l’exposition antérieure à l’azole et la thérapie actuelle au moment de l’échantillonnage ne permettent pas de prédire de manière fiable la détection des marqueurs de résistance aux azoles

Tableau Interrelations entre le traitement par Azole, le temps d’échantillonnage et la fréquence du marqueur de résistance aux azoles Expérience du traitement Azole détecté Nombre de patients avec marqueur de résistance à l’azole / total testé% Échantillon recueilli sur thérapie azole Totaux Itra Vori Posa Aucun Azole naïf – – – / / Itra uniquement / a – – / a / Posa seulement – – / a / / Itra vori / / – / / Itra Posa – – / – / Itra vori posa – – / a – / Totaux / / / / / Azole expérience de traitement Nombre de patients avec marqueur de résistance à l’azole / total testé% Échantillon prélevé sur la thérapie à l’azole Totaux Itra Vori Posa Aucun Azole naïf – – – / / Itra seulement / a – – / a / Posa seulement – – / a / / Itra vori / / – / / Itra Posa – – / – / Itra vori posa – – / a – / Totaux / / / / / NOTE Itra indique l’itraconazole; vori, voriconazole; posa, posaconazole M mutation n = Voir en grand

Résistance et résultat thérapeutique

Deux des trois patients qui n’avaient jamais reçu d’azoles avaient une LH et TR détectés; Les deux ont été traités avec de l’itraconazole et sont morts de CPA progressive en quelques mois. L’autre a été traité avec du posaconazole et est resté stable au cours des mois suivants Trois des patients avec le marqueur M ont échoué immédiatement l’itraconazole, le posaconazole et le quatrième Quelques mois plus tard Des patients avec des marqueurs LH et TR seulement étaient inappréciables, avaient échoué à l’itraconazole ou au voriconazole, et avaient stabilisé ou amélioré le posaconazole n =, l’itraconazole, ou le voriconazole. Le traitement de secours pour les infections résistantes au pan-azole comprenait trois fois Amphotéricine B liposomale hebdomadaire ou six fois par semaine micafungine ou caspofungine, à travers un Port-A-Cath

DISCUSSION

effets immunologiques ou stimulant des stéroïdes Une considération clé est de savoir si l’approche moléculaire pour trouver ou exclure la résistance démontrée ici est plus complète que la culture, ou trop sensible En microbiologie conventionnelle, une seule colonie est généralement sélectionnée pour les tests de sensibilité. Tout l’ADN d’Aspergillus dans un échantillon clinique permet la détection de génotypes de résistance présents seulement dans une sous-population de souches infectantes. Nous pensons que c’est la raison pour laquelle nous avons trouvé une fréquence de résistance plus élevée et une proportion de mutations isolats qui ont poussé en culture La culturabilité réduite sur agar mais pas nécessairement la virulence de certaines souches résistantes est aussi une explication possible de cette disparité La découverte inattendue de mutations multiples dans le même échantillon mais pas nécessairement la même souche MK et LH est nouvelle De même, la dissociation du TR et du LH n’a pas été décrite à ce jour. Une détection directe de la résistance à l’aide de méthodes moléculaires rapides facilite grandement la thérapie optimale pour chaque patient Non seulement la thérapie inefficace sera-t-elle évitée, mais des stratégies alternatives utilisant la thérapie combinée deviendront directement testables, avec des critères microbiologiques à la place. Toutefois, la traduction de la découverte d’une mutation cypA spécifique en une décision de traitement nécessite un travail supplémentaire pour tous les triazoles de deuxième génération, car notre compréhension de la résistance croisée est actuellement limitée. De plus, toutes les résistances ne sont pas médiées par les mutations cypA , alors que la détection d’un SNP clé aide à détecter la résistance et est plus sensible que la culture, un écran négatif n’exclut pas la résistance, comme le démontre un patient de cette série. , nouvelles mutations conférant une résistance Les probabilités de résistance au triazole dans les cultures de A fumigatus de cette ampleur ont été observées dans les établissements américains , et Des taux plus faibles mais très significatifs en Europe La présence de souches de fumigatus résistantes à l’azole dans l’environnement a été documentée en Europe Des souches résistantes ont été trouvées dans l’environnement dans de nombreux pays, notamment au Danemark et en Belgique; Les cellules fumigatus présentes dans l’air en Belgique étaient résistantes à l’itraconazole Ainsi, le poumon humain peut être un filtre d’Aspergilli dans l’air, et ce qui se trouve dans les échantillons reflète une exposition récente, en particulier chez les patients qui ne peuvent pas éliminer ce champignon De toute évidence, une thérapie antifongique en expansion rapide dans le monde favorisera la persistance de sous-populations résistantes. Nous sommes redevables à Chris Harris pour ses notes cliniques et à Sarah Follett, Adrian Moody et Gillian Morgan de Myconostica pour leur soutien et leur soutien. Ce travail a été soutenu Par le biais de subventions de Myconostica et l’Institut national de recherche en recherche médicale en médecine respiratoire, et les Instituts nationaux de la santé accordent AI à DSP Fonds du ministère de la Santé de l’Arabie Saoudite AB Le fonds de recherche sur les troubles granulomateux chroniques a été souscrite par le Fungal Research Trust depuis Conflits d’intérêts potentielsDWD détient des parts de fondateur dans FG Ltd et Myconostica Ltd, deux sociétés spin-off de l’Université de Manchester, et a reçu une subvention de FG ainsi que le Fungal Research Trust, le Wellcome Trust, le Moulton Trust, le Medical Research Council , Le Fonds de recherche sur les maladies chroniques granulomateuses, l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, l’Institut national de recherche en santé et l’Union européenne, AstraZeneca et Basilea Il continue d’agir en tant que conseiller / consultant auprès de FG et Myconostica. les dernières années, y compris Basilea, Vicuron maintenant Pfizer, Pfizer, Schering Plough, Nektar, Daiichi, Astellas, Gilead, et York Pharma Il a été payé pour des pourparlers au nom de Schering, Astellas, Merck, Dainippon, et Pfizer CL-F actes en tant que consultant pour Pfizer, Astellas et Schering Plough, et a été payé pour des discussions au nom de Pfizer, Astellas, Schering Plough, Merck, et Gilead CBM détient une subvention de Pfizer et est un shareho Elle a été payée pour des discussions au nom de Pfizer PB détient des subventions de l’UE, Fungal Research Trust, AstraZeneca, et Alergenitica, et est un actionnaire de Myconostica DSP reçoit le soutien de l’Institut national américain des allergies et des maladies infectieuses; Il a reçu le soutien de Pfizer et Merck et participe à des panels d’experts pour ces sociétés. Il est actionnaire de Myconostica. Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel